Méthodes d'isolement
Les procédures d'isolement des stéroïdes diffèrent selon la nature chimique des stéroïdes et l'échelle et le but de l'isolement. Les stéroïdes sont isolés de sources naturelles par extraction avec des solvants organiques, dans lesquels ils se dissolvent généralement plus facilement que dans les fluides aqueux des tissus. La matière source est souvent traitée initialement avec un solvant alcoolique, qui la déshydrate, dénature (rend insoluble) les protéines associées aux stéroïdes et dissout de nombreux stéroïdes. La saponification de tissus entiers ou de substances extraites de ceux-ci par l'alcool divise les molécules d'esters de stérols, de triglycérides et d'autres esters gras et permet l'extraction des stérols au moyen de solvants non miscibles à l'eau, tels que l'hexane ou l'éther, avec une purification considérable. Les esters de stérols intacts ou les stéroïdes hormonaux et leurs métabolites (composés produits par transformation biologique) qui sont sensibles aux acides forts ou aux alcalis, cependant, nécessitent des conditions d'isolement essentiellement neutres et, bien que certaines procédures d'analyse des stéroïdes urinaires utilisent un traitement acide, une hydrolyse plus douce, comme par les enzymes, est préféré. L'acidité de certains stéroïdes permet de les maintenir en solution alcaline, tandis que les impuretés non acides sont extraites avec des solvants organiques.
Commercialement, les stéroïdes abondants sont généralement purifiés par cristallisation répétée à partir de solvants. Les isolations en laboratoire à petite échelle à des fins d'investigation ou de dosage exploitent généralement des polarités différentes du stéroïde et de ses impuretés, qui peuvent être séparées par un partage entre des solvants de polarité différente ou par chromatographie (voir ci-dessous Détermination de la structure et méthodes d'analyse). Parfois, des réactifs spéciaux peuvent précipiter ou séquestrer de manière sélective le stéroïde souhaité. Un exemple classique est la précipitation de 3β-hydroxy stérols tels que le cholestérol par le dérivé de stéroïde naturel, la digitonine. Les nouveaux stéroïdes d'un grand intérêt physiologique ne sont souvent isolés des tissus qu'avec une extrême difficulté, car ils sont généralement des constituants traces. Dans un exemple, 500 kg (1 100 livres) de pupes de vers à soie ont donné 25 mg (0,0008 once) d'hormone de mue pure, l'ecdysone stéroïdienne (c.-à-d. Une purification 20 × 10 6 fois). Dans de tels cas, chaque étape d'isolement est suivie d'un test de l'activité physiologique pertinente pour s'assurer que le matériel souhaité est purifié. Le pourcentage de récupération des hormones stéroïdes connues au cours de leur essai dans de petits échantillons biologiques est généralement évalué en ajoutant une trace du même stéroïde sous forme radioactive à l'échantillon initial, suivi d'un essai radio (analyse basée sur la radioactivité) une fois la purification terminée. L'efficacité de récupération du stéroïde radioactif est supposée être la même que celle de la substance naturelle.
Détermination de la structure et des méthodes d'analyse
La décomposition systématique, par étapes, par des méthodes chimiques des systèmes d'anneaux stéroïdiens, utilisés dans les premières investigations de la structure, est principalement d'intérêt historique. Le petit nombre de structures nucléaires différentes trouvées dans les stéroïdes a souvent permis l'établissement de la structure d'un nouveau stéroïde par conversion en composés apparentés de structure connue. L'élucidation de la structure dans le domaine des stéroïdes, comme dans tous les domaines de la chimie organique, dépend fortement des méthodes physiques, en particulier la résonance magnétique nucléaire, la spectroscopie infrarouge, la spectrométrie de masse et la cristallographie aux rayons X. Les données obtenues par ces méthodes renforcent et remplacent souvent les critères classiques de caractérisation des stéroïdes: point de fusion, rotation optique, analyse élémentaire et absorption ultraviolette à une longueur d'onde fixe.
La chromatographie est une technique cruciale en chimie des stéroïdes. Le comportement d'un stéroïde dans des systèmes chromatographiques sélectionnés l'identifie souvent avec un degré de probabilité élevé. L'identification peut être rendue pratiquement certaine par la conversion du matériau en dérivés qui à leur tour sont examinés chromatographiquement. Des données abondantes sur le comportement des stéroïdes dans la chromatographie sur papier, la chromatographie sur couche mince, la chromatographie liquide et la chromatographie gaz-liquide montrent que les caractéristiques individuelles de la structure moléculaire déterminent les propriétés chromatographiques des stéroïdes de manière prévisible. Le chromatographe gaz-liquide ou le chromatographe liquide relié directement au spectromètre de masse permet d'obtenir simultanément des schémas de fragmentation spectrale de masse et des données chromatographiques gaz-liquide critiques, en utilisant un échantillon contenant moins d'un microgramme de stéroïde. Cette technique puissante prend une importance croissante dans l'analyse structurale des stéroïdes dans les extraits de fluides corporels tels que le sang et l'urine.
Synthèse totale des stéroïdes
Dans la plupart des synthèses totales de stéroïdes, un matériau de départ monocyclique tel qu'une quinone fournit un cycle sur lequel les autres cycles du noyau sont élaborés étape par étape par des réactions de condensation avec des molécules plus petites pour donner la stéréochimie souhaitée dans les fusions annulaires successives. Chaque nouvelle fermeture d'anneau doit également fournir des groupes fonctionnels qui peuvent être utilisés pour construire l'anneau suivant. Dans une approche assez différente, le contrôle stéréochimique des fusions cycliques est obtenu en utilisant le fait que dans des conditions acides, des molécules à chaîne ouverte contenant des doubles liaisons convenablement situées se cyclisent en structures multirésistantes qui ont la stéréochimie nécessaire et qui peuvent être relativement facilement converties en stéroïdes. De son analogie avec la cyclisation du 2,3-oxyde de squalène en lanostérol dans la biosynthèse du cholestérol (voir ci-dessous Biosynthèse et métabolisme des stéroïdes: cholestérol), cette méthode impliquerait une cyclisation de type biogénétique.
