Isoler le clone
En général, le clonage est entrepris afin d'obtenir le clone d'un gène particulier ou d'une séquence d'ADN d'intérêt. La prochaine étape après le clonage consiste donc à rechercher et à isoler ce clone parmi les autres membres de la bibliothèque. Si la bibliothèque englobe le génome entier d'un organisme, alors quelque part dans cette bibliothèque sera le clone souhaité. Il existe plusieurs façons de le trouver, selon le gène spécifique concerné. Le plus souvent, un segment d'ADN cloné qui présente une homologie avec le gène recherché est utilisé comme sonde. Par exemple, si un gène de souris a déjà été cloné, alors ce clone peut être utilisé pour trouver le clone humain équivalent dans une bibliothèque génomique humaine. Les colonies bactériennes constituant une bibliothèque sont cultivées dans une collection de boîtes de Pétri. Ensuite, une membrane poreuse est posée sur la surface de chaque plaque, et les cellules adhèrent à la membrane. Les cellules sont rompues et l'ADN est séparé en simples brins, tous sur la membrane. La sonde est également séparée en simples brins et marquée, souvent avec du phosphore radioactif. Une solution de la sonde radioactive est ensuite utilisée pour baigner la membrane. L'ADN sonde simple brin n'adhèrera qu'à l'ADN du clone qui contient le gène équivalent. La membrane est séchée et placée contre une feuille de film sensible aux radiations, et quelque part sur les films, un point noir apparaîtra, annonçant la présence et l'emplacement du clone souhaité. Le clone peut ensuite être récupéré à partir des boîtes de Pétri originales.
génétique: technologie de l'ADN recombinant et la réaction en chaîne de la polymérase
Les progrès techniques ont joué un rôle important dans l'avancement de la compréhension génétique. En 1970, les microbiologistes américains Daniel Nathans
séquençage ADN
Une fois qu'un segment d'ADN a été cloné, sa séquence nucléotidique peut être déterminée. La séquence nucléotidique est le niveau de connaissance le plus fondamental d'un gène ou d'un génome. C'est le plan qui contient les instructions pour la construction d'un organisme, et aucune compréhension de la fonction génétique ou de l'évolution ne pourrait être complète sans obtenir ces informations.
Les usages
La connaissance de la séquence d'un segment d'ADN a de nombreuses utilisations, et quelques exemples suivent. Premièrement, il peut être utilisé pour trouver des gènes, des segments d'ADN qui codent pour une protéine ou un phénotype spécifique. Si une région d'ADN a été séquencée, elle peut être criblée pour les traits caractéristiques des gènes. Par exemple, des cadres de lecture ouverts (ORF) - de longues séquences qui commencent par un codon de départ (trois nucléotides adjacents; la séquence d'un codon dicte la production d'acides aminés) et ne sont pas interrompus par des codons d'arrêt (sauf un à leur terminaison) - suggèrent un région codant pour les protéines. De plus, les gènes humains sont généralement adjacents à ce que l'on appelle les îles CpG, des amas de cytosine et de guanine, deux des nucléotides qui composent l'ADN. Si un gène avec un phénotype connu (tel qu'un gène de maladie chez l'homme) est connu pour être dans la région chromosomique séquencée, alors les gènes non attribués dans la région deviendront candidats à cette fonction. Deuxièmement, les séquences d'ADN homologues de différents organismes peuvent être comparées afin de tracer des relations évolutives à l'intérieur et entre les espèces. Troisièmement, une séquence de gènes peut être criblée pour les régions fonctionnelles. Afin de déterminer la fonction d'un gène, divers domaines peuvent être identifiés qui sont communs aux protéines de fonction similaire. Par exemple, certaines séquences d'acides aminés d'un gène se trouvent toujours dans des protéines qui couvrent une membrane cellulaire; ces étirements d'acides aminés sont appelés domaines transmembranaires. Si un domaine transmembranaire est trouvé dans un gène de fonction inconnue, cela suggère que la protéine codée est située dans la membrane cellulaire. D'autres domaines caractérisent les protéines de liaison à l'ADN. Plusieurs bases de données publiques de séquences d'ADN sont disponibles pour analyse par toute personne intéressée.
